一、為什么所有試劑和檢測樣本要平衡至室溫再進(jìn)行加樣操作?
溫度是ELISA試劑盒結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素。為了使所有樣本在一致的溫度下反應(yīng),實(shí)驗前務(wù)必將所有試劑平衡至室溫,包括檢測樣本。避免因溫度的動力學(xué)反應(yīng)差異而導(dǎo)致ELISA試劑盒檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。
二、為什么實(shí)驗過程中孵育、洗滌需要振蕩?如何振蕩?
振蕩孵育使反應(yīng)更充分,振蕩洗滌使背景更干凈。建議使用酶標(biāo)專用12孔微孔板振蕩器。
孵育過程振蕩,可以加快、加強(qiáng)抗原抗體分子間的相互碰撞接觸,使得反應(yīng)過程更加,OD值通常會比未振蕩孵育的結(jié)果要高;洗滌過程振蕩,可以使洗板更干凈,在很大程度這能降低背景值,同時可以提高試劑盒檢測的靈敏度。
三、何時終止ELISA試劑盒反應(yīng)?
ELISA試劑盒實(shí)驗終需要酶催化底物顯色反應(yīng)來完成,在佳時間終止反應(yīng)是ELISA試劑盒實(shí)驗成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反應(yīng)系統(tǒng)中,S9出現(xiàn)淡藍(lán)色,S1–S3有明顯的階梯型藍(lán)色,便需要終止反應(yīng);或者根據(jù)高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔在1220nm的OD值來決定,OD1220=0.-0.9之間時即可終止。
四、如何獲得良好線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線?
按照推薦方式保存標(biāo)準(zhǔn)品;溶解標(biāo)準(zhǔn)品之前需短暫離心,收集粉末;確保標(biāo)準(zhǔn)品溶解和混勻(大約10min),然再進(jìn)行續(xù)的系列稀釋步驟,確保每一步都充分混勻且精確移液;顯色的恰當(dāng)終止;選擇合適的數(shù)學(xué)擬合方程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
五、ELISA試劑盒實(shí)驗為什么必須設(shè)置復(fù)孔?
為獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗結(jié)果,強(qiáng)烈建議標(biāo)準(zhǔn)品及樣本進(jìn)行復(fù)孔檢測。因為復(fù)孔檢測可以:
計算平均值,確保實(shí)驗結(jié)果更準(zhǔn)確;
解決實(shí)驗中誤操作造成的跳孔現(xiàn)象;
計算CV值,對實(shí)驗的操作和試劑盒的精密度進(jìn)行評估。
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